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BCA Protein Assay Kit

產品名稱： BCA Protein Assay Kit
產品編號： Bio-BCA-500R
產品規格： 500assays
廠牌： BBI

詳細資料

BCA Protein Assay Kit（二秦可寧酸蛋白質定量試劑盒）產品技術規格書

一、產品基本資料

產品名稱：BCA 蛋白質定量試劑盒 (BCA Protein Assay Kit)
檢測波長：562 nm
線性範圍：20 – 2,000 µg/mL
操作時間：約 30 至 45 分鐘
儲存條件：內附之蛋白質標準品置於 2°C 至 8°C 短期冷藏，長期保存置於 -20°C；其餘核心試劑（Reagent A 與 Reagent B）置於室溫避光儲存。
產品用途：本產品僅限科學研究與實驗室研發使用，不得用於臨床診斷、人體或動物之醫療與食品。

二、化學與物理性質

檢測原理：在鹼性環境下，蛋白質將二價銅離子還原為一價銅離子，隨後 BCA 試劑與一價銅離子特異性螯合，形成高穩定性的深紫色複合物，其吸光度值與蛋白質濃度在線性範圍內呈正比。
蛋白質特異性：呈色反應主要由蛋白質胜肽鍵以及半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸等特定胺基酸共同引發，對不同蛋白質種類間的呈色變異性極低。
試劑組成：Reagent A 為含有 BCA、碳酸鈉、酒石酸鈉及碳酸氫鈉的鹼性緩衝液（澄清無色）；Reagent B 為 4% 硫酸銅溶液（澄清藍色）。

三、核心實驗應用情境

常規總蛋白質定量：
- 適用於各類細胞裂解液、組織勻漿、部分純化或完全純化後蛋白質樣本的總量分析。
高濃度去污劑樣本定量：
- 完美相容含有高達 5% SDS、Triton X-100、Tween-20、NP-40 及 Chaps 等常用非離子與離子型去污劑的蛋白質樣本。
管柱層析純化產物檢測：
- 用於評估親和層析（Affinity Chromatography）或離子交換層析等各流份中的蛋白質回收率與濃度。

四、標準操作步驟（96孔微孔板法）

步驟一：製備 BCA 工作液 (WR)
- 依據檢測孔數計算所需總體積。
- 依據 50 體計 Reagent A + 1 體積 Reagent B 的比例（50:1）混合均勻。
步驟二：製備序列稀釋標準品
- 使用與待測樣本相同的緩衝液，將 2 mg/mL BSA 標準品進行序列稀釋。
- 建議梯度濃度為：2000、1500、1000、750、500、250、125、25 以及 0 µg/mL（空白對照）。
步驟三：加樣反應
- 於 96 孔微孔板的對應孔中，分別加入 20 µL 的各濃度標準品或待測樣本。
- 每孔各加入 200 µL 的 BCA 工作液，並使用微孔板振盪器輕柔混合 30 秒。
步驟四：溫育與讀值
- 用微孔板密封膜封口，置於 37°C 溫育 30 分鐘（或室溫溫育 2 小時）。
- 移出微孔板並冷卻至室溫。
- 使用酶標儀讀取 562 nm 處的吸光度值，並扣除空白對照值後繪製標準曲線以計算樣本濃度。

五、去污劑與常見化學物質最大耐受濃度對照表
若樣本中的緩衝液成分超過以下最大耐受濃度，將會嚴重干擾呈色反應或產生沉澱：

非離子型去污劑 (Non-ionic Detergents)：
- Triton X-100：5.0%
- Triton X-114：1.0%
- Tween-20：5.0%
- Tween-80：5.0%
- Nonidet P-40 (NP-40)：5.0%
- Brij-35：5.0%
- Octyl β-glucoside：5.0%
離子型去污劑 (Ionic Detergents)：
- SDS (Sodium dodecyl sulfate)：5.0%
- CHAPS：5.0%
- CHAPSO：5.0%
- Deoxycholate (去氧膽酸鈉)：5.0%
常見緩衝鹽與鹽類 (Buffers & Salts)：
- Tris：250 mM
- HEPES：100 mM
- MES：100 mM
- Phosphate buffer (磷酸鹽緩衝液)：100 mM
- NaCl (氯化鈉)：5 M
- Glycerol (甘油)：10%
還原劑與螯合劑（極易干擾，需嚴格限制）：
- DTT (Dithiothreitol)：1 mM
- 2-Mercaptoethanol (2-ME)：1 mM
- TCEP：1 mM
- EDTA：10 mM

六、核心操作注意事項

工作液即配即用：
- 混合後的工作液在室溫下穩定，但仍建議當天配製並在數小時內使用完畢。
溫育條件一致性：
- 由於 BCA 反應屬於非終點式呈色反應，呈色深度會隨時間持續加深，因此所有樣本、空白對照與標準品必須同時加入工作液並在相同溫度下溫育。
還原劑干擾排查：
- 傳統 BCA 法極易受到二硫鍵還原劑的干擾。若樣本緩衝液中的還原劑濃度超過對照表上限，會直接將銅離子還原而導致背景呈現極深的紫色，此類樣本請改用還原劑相容型試劑盒。
螯合劑與脂質限制：
- 緩衝液中若含有高濃度的 EDTA（大於 10 mM）會與 BCA 競爭銅離子，導致呈色受阻；若脂質濃度過高則易引起背景值偏高或產生沉澱，檢測前須確保化學物質濃度低於系統耐受極限。

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